Dados do Trabalho

Título

UNC0642 NA VIABILIDADE DE CELULAS DE CULTURA PRIMARIA E DE LINHAGEM DE MELANOMA METASTATICO HUMANO

Resumo

INTRODUÇÃO: O melanoma cutâneo é uma neoplasia de alta mortalidade. Sua incidência cresce cada vez mais, mundialmente, e novas opções de terapia para casos avançados são necessárias. A superexpressão da histona lisina metiltransferase (G9a), encarregada pela mono e dimetilação da histona H3 lisina 9, proporciona o desenvolvimento do melanoma por meio da regulação positiva da via de sinalização Notch, via Wnt e autofagia. O UNC0642, um inibidor seletivo da G9a, associa-se ao substrato (histona) tornando-o inacessível a G9a e portanto bloqueando o desenvolvimento do melanoma. OBJETIVO: Caracterizar o efeito in vitro da UNC0642 na viabilidade celular em linhagem de melanoma metastático humano (SKMEL-24) e em culturas primárias de melanoma metastático humano (CPMM). MÉTODO: Foram coletados fragmentos de metástase tumoral de melanoma em pacientes operados no Hospital São Paulo. Os fragmentos foram enviados para o laboratório de cirurgia translacional da UNIFESP e para o laboratório do Hospital Israelita Albert Einstein, onde foram caracterizadas e isoladas células de linhagem SK-MEL-24 e CPMM de melanoma metastático humano. Após caracterização as células foram cultivadas e tratadas com a droga UNC0642 diluída em DMSO nas concentrações de 5, 7,5 e 10nM e analisadas em 24 e 48 horas por citometria de fluxo e foi avaliada apoptose inicial, tardia ou necrose. As amostras tratadas foram comparadas com o controle e o DMSO. A estatística foi realizada utilizando One Way ANOVA. RESULTADOS: A SK-MEL-24 tratada com UNC0642 apresentou alta taxa de mortalidade comparada ao controle e ao DMSO, sendo dose e tempo dependente. As CPMM apresentaram morte basal maior que a SK-MEL e foram menos sensíveis ao tratamento, uma vez que, embora a apoptose inicial tenha sido maior inicialmente, não foi verificada a evolução para apoptose tardia ou necrose, mesmo após 24hs. O IC50 para a SK-MEL-24 e CPMM foi de 10nM em 24hs após exposição à droga. CONCLUSÃO: A UNC0642 aumenta a mortalidade celular total, apoptose inicial e tardia ou necrose tanto na linhagem SK-MEL-24 quanto nas CPMM. O IC50 da droga foi determinado fornecendo dados para o inicio de estudos in vivo em melanoma metastático.

Introdução

A incidência do melanoma cutâneo, o mais letal dos cânceres de pele, está aumentando no mundo todo. Em 2018, de acordo com a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer, foram diagnosticados 287.723 novos casos da doença, com 60.712 mortes em sua decorrência. O Instituto também estima um aumento de 62% na incidência do melanoma até 2040, com possibilidade de 466.914 novos casos naquele ano, e um aumento de 74% na mortalidade por essa neoplasia1,2.
As prevenções primária e secundária são a melhor arma no combate ao melanoma cutâneo, neoplasia maligna de alta mortalidade.3 Infelizmente, ainda vivemos numa condição em que muitos pacientes portadores de melanoma têm sua doença diagnosticada em estádio avançado e, apesar dos avanços na imunoterapia e terapia alvo, mais da metade deles não respondem ao tratamento e vão a óbito pelo melanoma4,5. Assim, são necessários avanços no tratamento do melanoma sistêmico.
Embora o câncer seja comumente considerado uma doença que surge principalmente do acúmulo de mutações genéticas, alterações na modificação do DNA e das histonas (epigenoma) também contribuem para seu início e progressão6. O DNA é empacotado na cromatina pelas histonas formando os nucleossomos. O nucleossomo é organizado em torno de um octâmero composto por duas moléculas de cada proteína histona, H2A, H2B, H3 e H4, com 145 pares de base envolvidos7. As histonas são proteínas essenciais caracterizadas por um domínio carboxi-terminal globular e uma cauda N-terminal saliente e rica em lisina. As caudas N-terminais das histonas estão sujeitas a modificações covalentes reversíveis, que afetam finalmente a expressão gênica. As histonas podem sofrer uma série de modificações pós-traducionais, incluindo acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitinação e sumoilação8. Essas modificações regulam a capacidade dos fatores de transcrição de acessar o DNA subjacente, modificando a afinidade das histonas pelo seu arcabouço de açúcar carregado negativamente, representando um mecanismo regulador fundamental, capaz de impactar a transcrição, replicação e estabilidade da cromatina.
A desregulação desses processos é uma marca registrada do câncer. G9a, uma histona lisina metiltransferase responsável pela monodimetilação e dimetilação da histona H3 lisina 9 (H3K9), uma modificação reversível geralmente associada ao silenciamento de genes transcricionais, foi observada participar em diferentes tipos de câncer, e sua superexpressão tem sido associada a um mau prognóstico. A superexpressão anormal de G9a nas células de melanoma promove a progressão do câncer através da regulação positiva da via de sinalização Nocth111,12,13. Outros fatores também podem estar relacionados a capacidade de disseminação metastática do melanoma, como a superexpressão da proteína FOXP314, polimorfismos do fator de crescimento epidermal (EGF)15e os receptores HER1, HER2, HER3 e HER4.
Vários inibidores de pequenas moléculas foram desenvolvidos com a capacidade de inibir a atividade catalítica de G9a e foram utilizados em várias experiências in vitro e in vivo. G9a catalisa a metilação da histona 3-lisina 9 (H3K9) e histona 3-lisina 27 (H3K27). Liu e seu grupo relataram a síntese do inibidor de G9a e GLP adequado para estudos em animais, UNC0642. Esta molécula demonstra uma farmacocinética aprimorada, enquanto mantem alta seletividade e baixa toxicidade celular, .
A administração de UNC0642 reduz significativamente a expressão de Notch1 e diminui o nível de Hes1 na linhagem de melanoma A375. O bloqueio de G9a inibe a proliferação e metástase de células de melanoma humano. Inibição de G9a com UNC0642 reduz a atividade da sinalização Notch em células de melanoma humano e em células normais da pele.
Alguns estudos demonstraram maior seletividade de UNC0642 para G9a e GLP em relação a 13 outras metiltransferases34, e é importante ressaltar que atualmente ainda não há inibidores de G9a em ensaios clínicos.

Objetivo

Caracterizar o efeito in vitro da UNC0642 na viabilidade celular em linhagem de melanoma metastático humano (SKMEL-24) e em culturas primárias de melanoma metastático humano (CPMM).

Método

1- Obtenção de fragmento de metástase
Um fragmento da metástase tumoral foi obtido durante a cirurgia de ressecção de metástases de pacientes maiores de 18 anos, portadores de melanoma metastático avançado (estádio clínico III e IV), operados no Hospital São Paulo da UNIFESP. Foram captados 2 fragmentos do tumor com cerca de 0,5 cm cúbico cada. Serão utilizados espécimes de 10 pacientes.
2- Processamento do tumor para o estabelecimento de cultura primária de células metastáticas
a) Explante – A técnica de explante se caracteriza pela cultura de um fragmento da metástase. De forma geral, o fragmento de tecido metastático é obtido a partir do fragmento cirúrgico derivado de excisão de tecido metastático. O fragmento foi colocado em placa de cultura de 6 poços após ser lavado com antibiótico-antimicótico 1x (Gibco). O fragmento foi colocado no poço e em seguida colocadas 2 gotas de soro humano AB sobre o fragmento, o mesmo é mantido em estufa de CO2 por 24hs e após esse período o meio de cultivo para melanoma (composto pelos meios RPMI, F12 HAM, DMEM e 10% de soro fetal bovino) foi adicionado com muito cuidado no poço para que o fragmento permaneça aderido.
b) Digestão de fragmento de metástase – A digestão do fragmento de metástase foi utilizando um kit de dissociação de tumor (MiltenyiBiotec - Alemanha), para que o tecido alvo seja transformado em suspensão simples contendo as células dissociadas. Após a dissociação do tecido pelas enzimas contidas no kit, o material foi lavado com o meio de cultivo de melanoma e metade do material colocado em cultura em placa de cultura de 6 poços a outra metade utilizada para a etapa seguinte que inclui a seleção de células que expressam o marcador tumoral MCSP (human melanoma-associatedchondroitin sulfate proteoglycan).
c) Seleção de células expressando MCSP - Após a digestão do fragmento de metástase conforme descrito acima metade das células foram marcadas com anticorpo humano anti-MCSP associados a esferas magnéticas. Após a marcação das células com anti-MCSP as células foram selecionadas por coluna magnética, ficando retidas na coluna apenas as células que expressarem MCSP na membrana. Em seguida a coluna foi retirada do magneto e as células que expressam MCSP foram liberadas em um novo tubo de coleta. As células MCSP foram lavadas com o meio de cultivo de melanoma e colocadas em cultura em placa de cultura de 6 poços.
3- Caracterização das culturas primárias
Uma alíquota das células da cultura primária foi fixada em lâminas de vidro. O procedimento foi realizado utilizando micropipetas colocando-se 40µl de polilisina em cada área da lâmina, que permaneceu em repouso durante 1 hora. Após esse intervalo, o excesso da polilisina foi aspirada e logo em seguida será adicionado 20µl da suspensão de células. Após intervalo de 1 hora, o material foi fixado com 20µl de álcool absoluto. As lâminas foram armazenadas em frasco também com álcool absoluto e encaminhadas para o setor de Patologia. O diagnóstico da cultura foi confirmado através da imuno-histoquímica utilizando a proteína S-100, Melan-A e HMB-45 (Human Melanoma Black), marcadores frequentemente utilizados para diagnóstico do melanoma.
4- Curva de dose-resposta e determinação do IC50
As células em cultura com confluência em torno de 80% foram incubadas na presença de doses escalonadas de UNC0642 (concentrações de 0 a 20µM) por até 72 h. O valor de concentração que proporciona 50% de inibição da viabilidade celular (IC50) foi determinado a partir da curva de dose resposta que será construída em um programa estatístico.
5- Avaliação da resposta a UNC0642 em modelo de cultura 3D
A cultura de melanoma (linhagem SK-MEL ou primária) será tripsinizada e ressuspendida em meio de cultura, 250 células foram coletadas e depositadas na tampa de uma placa de cultura, essa tampa, então foi virada na placa contendo 5ml de PBS e incubada em estufa por 10-14 dias. Após 5 dias meio de cultura, será adicionado a placa6,38.
Outra técnica que foi utilizada para formação de esferoides será o sistema de cultura 3D NuclonSphera (cód: 174929 - ThermoScientific), as superfícies destas placas de cultura não permitem a adesão celular viabilizando o estabelecimento de esferoides 3D via agregação célula-célula através da secreção natural de matriz extracelular (ECM). A formação dos esferoides pode ser avaliada e acompanhada por microscopia ótica.
6- Ensaio de viabilidade celular por citometria de fluxo
O ensaio de viabilidade celular foi realizado por citometria de fluxo, utilizando Anexina-V e Iodeto de propídeo. A anexina-V se liga à fosfadilserina que é um fosfolipideo que geralmente ocupa a camada interna da membrana celular. Quando a célula entra em apoptose (apoptose inicial) ocorre a translocação da fosfatildeserinada parte interna da membrana celular para seu exterior, podendo então ser identificada pela ligação com Anexina-V fluorescenteporcitometria de fluxo. O iodeto de propídeo é um corante fluorescente, que só penetra na célula caso ocorra dano ou poros na membrana (apoptose tardia ou necrose) podendo também ser identificado por citometria de fluxo. Para este ensaio utilizamos o Kit - FITC Annexin V ApoptosisDetection (BD Pharmingen) de acordo com as indicações do fabricante. A aquisição das amostras foi realizada nocitômetro de Fluxo FORTESSA (BD Biosciences) e as análises pelo software FlowJo.

Resultado

A SK-MEL-24 tratada com UNC0642 apresentou alta taxa de mortalidade comparada ao controle e ao DMSO, sendo dose e tempo dependente (Figura 1 A-F). As CPMM apresentaram morte basal maior que a SK-MEL e foram menos sensíveis ao tratamento, uma vez que, embora a apoptose inicial tenha ocorrido em maior indicice inicialmente, não foi verificada a evolução para apoptose tardia ou necrose, mesmo após 24hs (Figura 2 A-F).

Nas análises de apoptose inicial e tardia ou necrose, o resultado da SK-MEL-24 manteve-se significativo para apoptose tardia ou necrose, enquanto para apoptose inicial, o percentual se manteve alto nas doses de acima de 7,5mM após 24h comparadas ao controle (Figura 1B-C e 2E-F). Para a CPMM o resultado se manteve significativo apenas para a apoptose inicial (Figura 2 B e 3E)

Discussão

O UNC0642, induz morte celular na linhagem SK-MEL-24 e CPMM. O IC50 para a SK-MEL-24 e CPMM foi de 10nM em 24hs após exposição à droga. A indução de morte celular nestas células corrobora Dang et al, 2021 no estudo de células de melanoma in vitro e in vivo.

Conclusão

A UNC0642 aumenta a mortalidade celular total, apoptose inicial e tardia ou necrose tanto na linhagem SK-MEL-24 quanto nas CPMM. O IC50 da droga foi determinado fornecendo dados para o inicio de estudos in vivo em melanoma metastático.

Referências

1. Ferlay J, Ervik M, Lam F, Colombet M, Mery L, Piñeros M, Znaor A, Soerjomataram I, Bray F. IARC (a): Global Cancer Observatory. Cancer Today[Internet].2018. 3º de abril de 2021
2. Suozzi K, Turban J, Girardi M. Cutaneous Photoprotection: A Review of the Current Status and Evolving Strategies. Yale J Biol Med[Internet]. 2020; 3º de abril de 2021 [citado 9º de abril de 2021]; 93(1): 55-67. Disponível em:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7087054/ .
3. Marconi A, Quadri M, Saltari A, Pincelli C. Progress in melanoma modelling in vitro. ExpDermatol[Internet]. 2018;3º de abril de 2021
4. Müller I, Kulms D. A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model. J Vis Exp[Internet]. 2018; 3º de abril de 2021
5. Bedogni B, Warneke J, Nickoloff BJ, Giaccia AJ, Powell MB.Notch1 is an effector of Akt and hypoxia in melanoma development. J Clin Invest[Internet]. 2008

Palavras Chave

Melanoma; UNC0642; viabilidade celular

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